Kromatografi

March 5, 2014

Kromatografi

Kromatografi adalah metode pemisahan kimia yang didasarkan pada adanya perbedaan partisi zat pada fasa diam dan fasa gerak. Tujuan kromatografi dapat bersifat preparatif yaitu pemisahan (untuk pemurnian) atau analitik (perbandingan).

  • Eluen, pelarut yang digunakan untuk memisahkan analit
  • Fasa Diam, Fasa yang tetap pada tempatnya
  • Fasa Gerak, Fasa zat yang bergerak pada arah tertentu
  • Waktu Retensi, waktu yang diperlukan analit untuk melewati sistem
  • Volume Retensi, volume fasa gerak yang dibutuhkan untuk mengelusi komponen analit.

Fasa Diam, adanya interaksi dengan fasa diamlah terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen senyawa analit. Fasa Diam dapat berupa bahan padat atau porous(berpori), atau cairan yang dilapiskan pada padatan pendukung. Fasa Gerak, pembawa analit dapat bersifat inert maupun berinteraksi dengan analit tsb.. Kecepatan (laju) migrasi solut dipengaruhi oleh perbandingan distribusinya (KD atau D) yang ditentukan oleh afinitas relatif solut pada FD dibanding FG :

KD = Cons. analit pada fasa diam/ Cons. analit pada fasa gerak
KD semakin besar maka waktu retensi semakin besar (lama). Waktu retensi lama artinya migrasi akan semakin lambat.

Mekanisme Pemisahan Analit:
1) Adsorbsi, fasa diam: padat; fasa gerak: Cair (gas), dasar pemisahan: stereokimia

2) Partisi, fasa diam: cair; fasa gerak: Cair/gas, dasar pemisahan: Partisi-konsep like dissolves like.

3) Penukar Ion (ion exchange) mekanisme pemisahan karena adanya interaksi ionik antara fasa diam dan solut.

1. Penukar Anion

2. Penukar Kation

February 13, 2014

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

KCKT

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut dengan Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an.

HPLC adalah instrumen yang menggunakan prinsip kromatografi (pemisahan) dengan menggunakan fase diam menuju detektor dengan bantuan pompa. Di dalam kolom terjadi pemisahan, senyawa senyawa dalam kolom akan keluar berdasarkan kepolaran yang berbeda. Senyawa senyawa yang kurang interaksinya dengan fasa diam akan keluar lebih dahulu dan sebaliknya.

Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

hplc

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.


Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.


Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.


Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.

 

Kolom, ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.

 

Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.


Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa- senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika – silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sbg pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.

Detektor

  • Universal
  • Spesifik

just for review, let’s learn more